W tym wpisie na blogu przedstawię przejrzysty przegląd zasad i tła mikroskopii STED, a także jej zastosowań biologicznych i znaczenia.

Znaczenie mikroskopów i ich istniejące ograniczenia

Mikroskopy odegrały kluczową rolę w biologii. Wynalezienie mikroskopu doprowadziło do odkrycia komórek i od tego czasu biologia poczyniła ogromne postępy. Jednak tradycyjne mikroskopy optyczne mają nieodłączne ograniczenia fizyczne, które utrudniają obserwację drobnych struktur wewnątrz komórek lub układów w skali nano.
W szczególności technologie optyczne, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, wykorzystują światło widzialne, więc ich rozdzielczość jest ograniczona długością fali światła; zazwyczaj struktury o długości mniejszej niż połowa długości fali światła (około 200 nm) są trudne do rozróżnienia. Pomimo możliwości obserwacji żywych próbek, występował problem polegający na tym, że światło z dwóch punktów bardzo blisko siebie powodowało interferencję podczas przechodzenia przez soczewkę obiektywu, uniemożliwiając ich rozróżnienie.

Podstawowe koncepcje stanów wzbudzonych i fluorescencji

Aby zrozumieć zasadę działania STED, należy najpierw zrozumieć kwantowe koncepcje „stanu podstawowego” i „stanu wzbudzonego”. Dopóki cząsteczka nie otrzyma energii, pozostaje w stabilnym stanie podstawowym. Po pobraniu wystarczającej ilości energii z zewnętrznego źródła, poziom energetyczny cząsteczki wzrasta i przechodzi ona w stan wzbudzony.
Cząsteczka w stanie wzbudzonym powraca do stanu podstawowego w bardzo krótkim czasie, emitując światło o energii równej różnicy energii między stanem wzbudzonym a podstawowym – czyli fluorescencję. Detekcja tego sygnału fluorescencji w celu uzyskania obrazu próbki jest podstawową zasadą mikroskopii fluorescencyjnej.

Jak działa mikroskopia STED

Mikroskopia STED (mikroskopia z wymuszonym zubożeniem emisji) to, jak sama nazwa wskazuje, metoda sztucznie zawężająca obszar obserwacji poprzez zubożenie fluorescencji za pomocą emisji wymuszonej. Krótko mówiąc, jest to strategia polegająca na tłumieniu otaczającej fluorescencji, aby ograniczyć faktycznie obserwowany sygnał fluorescencji do bardzo małego obszaru.
Proces przebiega następująco. Najpierw pierwsza wiązka lasera jest kierowana na próbkę, wzbudzając cząsteczki w obszarze, w który trafia. W tym momencie cząsteczki w tym obszarze są gotowe do emisji fluorescencji. Zaraz potem, na ten sam obszar nakładany jest drugi laser; ta druga wiązka jest regulowana tak, aby miała rozkład natężenia w kształcie torusa.
Po nałożeniu wiązki lasera w kształcie pączka, emisja wymuszona występuje w większości obszaru, z wyjątkiem bardzo małego punktu centralnego, co zmusza wzbudzone cząsteczki do powrotu do stanu podstawowego. W rezultacie fluorescencja jest obserwowana tylko w niezwykle małym obszarze centralnym (w skali nano), podczas gdy obszary otaczające tracą fluorescencję. Przesuwając (skanując) laser, jednocześnie stopniowo zmniejszając rozmiar tego centralnego obszaru fluorescencyjnego, można uzyskać obraz całej próbki o wysokiej rozdzielczości.
Podsumowując, obszar obserwacji można przedstawić w postaci trzech obszarów przestrzennych: całego obszaru wzbudzonego pierwszym laserem, otaczającego obszaru, w którym fluorescencja jest wygaszana przez laser o kształcie torusa, oraz bardzo małego obszaru centralnego, w którym fluorescencja jest faktycznie emitowana i obserwowana. Dzięki interakcji tych trzech obszarów możliwa jest obserwacja wykraczająca poza konwencjonalną granicę dyfrakcji.
Tradycyjna mikroskopia fluorescencyjna indukuje fluorescencję za pomocą jednego rodzaju światła i uzyskuje obrazy wyłącznie na podstawie tej fluorescencji. W związku z tym trudno było rozróżnić struktury mniejsze niż 200 nm ze względu na ograniczenie dyfrakcyjne. Natomiast mikroskopia STED wyróżnia się połączeniem dwóch laserów w czasie i przestrzeni, co tłumi otaczającą fluorescencję, zmniejszając w ten sposób efektywny rozmiar punktu obserwacji i omijając ograniczenie dyfrakcyjne.

Wkład piekła i obecne znaczenie STED

Dr Stefan Hell po raz pierwszy zaproponował tę koncepcję teoretycznie w 1994 roku, a w 2000 roku z powodzeniem zbudował mikroskop STED, generujący obrazy o znacznie wyższej rozdzielczości niż konwencjonalne mikroskopy optyczne. Przedstawił wyniki wykazujące około trzykrotnie lepszą rozdzielczość obrazów E. coli i przyczynił się do poszerzenia naszej wiedzy o strukturach synaptycznych poprzez obserwację żywych komórek nerwowych.
Jednak sprzęt STED jest często trudny we wdrożeniu i kosztowny, dlatego nie został jeszcze powszechnie przyjęty we wszystkich laboratoriach. Niemniej jednak osiągnięcie rozdzielczości nanoskalowej za pomocą mikroskopu optycznego stanowiło istotny punkt zwrotny w podstawowych badaniach biologicznych i chemicznych.