Šajā emuāra ierakstā es sniegšu skaidru pārskatu par STED mikroskopijas principiem un pamatojumu, kā arī tās bioloģiskajiem pielietojumiem un nozīmi.

Mikroskopu nozīme un to esošie ierobežojumi

Mikroskopi ir bijuši izšķirošs instruments bioloģijā. Mikroskopa izgudrošana noveda pie šūnu atklāšanas, un kopš tā laika bioloģija ir guvusi milzīgus panākumus. Tomēr tradicionālajiem optiskajiem mikroskopiem ir raksturīgi fiziski ierobežojumi, kas apgrūtina smalko struktūru novērošanu šūnās vai to izkārtojumu nanoskalā.
Jo īpaši optiskās tehnoloģijas, piemēram, fluorescences mikroskopija, izmanto redzamo gaismu, tāpēc to izšķirtspēju ierobežo gaismas viļņa garums; parasti struktūras, kas ir mazākas par pusi no gaismas viļņa garuma (aptuveni 200 nm), ir grūti atšķirt. Neskatoties uz priekšrocību, ka var novērot dzīvus paraugus, radās problēma, kad gaisma no diviem punktiem, kas atrodas ļoti tuvu viens otram, izraisīja interferenci, izejot caur objektīvu, padarot tos neatšķiramus.

Uzbudināto stāvokļu un fluorescences pamatjēdzieni

Lai izprastu STED principu, vispirms ir jāsaprot kvantu mehānikas jēdzieni "pamatstāvoklis" un "ierosinātais stāvoklis". Ja vien molekula nesaņem enerģiju, tā paliek stabilā pamatstāvoklī. Kad tā absorbē pietiekami daudz enerģijas no ārēja avota, molekulas enerģijas līmenis paaugstinās, un tā nonāk ierosinātā stāvoklī.
Uzbudinātā stāvoklī esoša molekula ļoti īsā laikā atgriežas pamatstāvoklī, izstarojot gaismu, kas vienāda ar enerģijas starpību starp ierosināto un pamatstāvokli, tas ir, fluorescenci. Šī fluorescences signāla noteikšana, lai iegūtu parauga attēlu, ir fluorescences mikroskopijas pamatprincips.

Kā darbojas STED mikroskopija

STED mikroskopija (stimulētās emisijas samazināšanas mikroskopija), kā norāda nosaukums, ir metode, kas mākslīgi sašaurina novērošanas laukumu, samazinot fluorescenci, izmantojot stimulēto emisiju. Īsāk sakot, tā ir stratēģija, kas nomāc apkārtējo fluorescenci, lai faktiski novēroto fluorescences signālu ierobežotu ļoti mazā laukumā.
Konkrētais process ir šāds. Vispirms uz paraugu tiek vērsts pirmais lāzera stars, ierosinot molekulas zonā, kurā tas trāpa. Šajā brīdī molekulas šajā zonā ir gatavas izstarot fluorescenci. Tūlīt pēc tam uz tā paša apgabala tiek uzlikts otrs lāzers; šis otrais stars tiek noregulēts tā, lai intensitātes sadalījums būtu riņķa formas.
Kad riņķa formas lāzers tiek uzklāts uz virsmas, stimulētā emisija notiek lielākajā daļā apgabala, izņemot ļoti mazu centrālo punktu, piespiežot ierosinātās molekulas atgriezties pamatstāvoklī. Tā rezultātā fluorescence tiek novērota tikai ārkārtīgi mazajā centrālajā apgabalā (nanoskalā), savukārt apkārtējās zonas zaudē savu fluorescenci. Pārvietojot (skenējot) lāzeru, vienlaikus pakāpeniski samazinot šī centrālā fluorescējošā apgabala izmēru, var iegūt visa parauga augstas izšķirtspējas attēlu.
Rezumējot, novērošanas laukumu var raksturot kā trīs telpiskus reģionus: visu laukumu, ko ierosina pirmais lāzers, apkārtējo reģionu, kurā fluorescenci dzēš riņķa formas lāzers, un ļoti mazo centrālo reģionu, kurā fluorescence faktiski tiek izstarota un novērota. Pateicoties šo trīs reģionu mijiedarbībai, kļūst iespējams novērojums ārpus parastās difrakcijas robežas.
Tradicionālā fluorescences mikroskopija inducē fluorescenci, izmantojot viena veida gaismu, un iegūst attēlus, pamatojoties tikai uz šo fluorescenci; tāpēc difrakcijas robežas dēļ bija grūti izšķirt struktūras, kas mazākas par 200 nm. Turpretī STED izceļas ar to, ka tā apvieno divus lāzerus laikā un telpā, lai nomāktu apkārtējo fluorescenci, tādējādi samazinot novērošanas punkta efektīvo izmēru un apejot difrakcijas robežu.

Elles ieguldījums un STED pašreizējā nozīme

Dr. Stefans Hells šo koncepciju teorētiski pirmo reizi ierosināja 1994. gadā, un 2000. gadā viņš veiksmīgi uzbūvēja STED mikroskopu, kas radīja attēlus ar ievērojami augstāku izšķirtspēju nekā parastajiem optiskajiem mikroskopiem. Viņš ziņoja par rezultātiem, kas liecināja par aptuveni trīs reizes uzlabotu E. coli attēlu izšķirtspēju, un, novērojot dzīvas nervu šūnas, deva ieguldījumu mūsu izpratnes paplašināšanā par sinaptiskajām struktūrām.
Tomēr STED iekārtas bieži vien ir grūti ieviešamas un dārgas, tāpēc tās vēl nav plaši ieviestas visās laboratorijās. Neskatoties uz to, nanoskalas izšķirtspējas sasniegšana, izmantojot optisko mikroskopu, iezīmēja nozīmīgu pagrieziena punktu bioloģijas un ķīmijas pamatpētījumos.