U ovom blog postu pružit ću jasan pregled principa i pozadine STED mikroskopije, kao i njezinih bioloških primjena i značaja.
Važnost mikroskopa i njihova postojeća ograničenja
Mikroskopi su bili ključni alat u biologiji. Izum mikroskopa doveo je do otkrića stanica i od tada je biologija napravila ogroman napredak. Međutim, tradicionalni optički mikroskopi imaju inherentna fizička ograničenja, što otežava promatranje finih struktura unutar stanica ili rasporeda na nanoskali.
Posebno, optičke tehnologije poput fluorescentne mikroskopije koriste vidljivu svjetlost, pa je njihova rezolucija ograničena valnom duljinom svjetlosti; općenito, strukture manje od polovice valne duljine svjetlosti (približno 200 nm) teško je razlikovati. Unatoč prednosti mogućnosti promatranja živih uzoraka, postojao je problem gdje je svjetlost iz dvije točke vrlo blizu jedna drugoj uzrokovala interferenciju dok je prolazila kroz objektiv, čineći ih nerazlučivim.
Osnovni koncepti pobuđenih stanja i fluorescencije
Da bi se razumio princip STED-a, prvo se moraju razumjeti kvantno-mehanički koncepti "osnovnog stanja" i "pobuđenog stanja". Sve dok molekula ne primi energiju, ostaje u stabilnom osnovnom stanju. Kada apsorbira dovoljno energije iz vanjskog izvora, energetska razina molekule raste i ona ulazi u pobuđeno stanje.
Molekula u pobuđenom stanju vraća se u osnovno stanje u vrlo kratkom vremenu, emitirajući svjetlost jednaku energetskoj razlici između pobuđenog i osnovnog stanja - to jest, fluorescenciju. Detekcija ovog fluorescentnog signala za dobivanje slike uzorka osnovni je princip fluorescentne mikroskopije.
Kako STED mikroskopija funkcionira
STED mikroskopija (mikroskopija sa stimuliranom emisijom i smanjenjem fluorescencije) je, kao što i samo ime govori, metoda koja umjetno sužava područje promatranja smanjenjem fluorescencije pomoću stimulirane emisije. Ukratko, to je strategija koja potiskuje okolnu fluorescenciju kako bi se stvarno opaženi signal fluorescencije ograničio na vrlo malo područje.
Specifičan postupak je sljedeći. Prvo se prva laserska zraka usmjerava na uzorak, pobuđujući molekule u području koje pogađa. U ovom trenutku, molekule u tom području spremne su emitirati fluorescenciju. Odmah nakon toga, drugi laser se superponira na isto područje; ova druga zraka se podešava tako da ima raspodjelu intenziteta u obliku krafne.
Kada se laser u obliku krafne superponira, stimulirana emisija se javlja u većem dijelu područja osim u vrlo maloj središnjoj točki, prisiljavajući pobuđene molekule da se vrate u osnovno stanje. Kao rezultat toga, fluorescencija se opaža samo u izuzetno malom središnjem području (na nanoskali), dok okolna područja gube fluorescenciju. Pomicanjem (skeniranjem) lasera uz progresivno smanjenje veličine ovog središnjeg fluorescentnog područja može se dobiti slika visoke rezolucije cijelog uzorka.
Ukratko, područje promatranja može se konceptualizirati u smislu tri prostorna područja: cijelo područje pobuđeno prvim laserom, okolno područje gdje se fluorescencija gasi laserom u obliku krafne i vrlo malo središnje područje gdje se fluorescencija zapravo emitira i promatra. Interakcijom ova tri područja moguće je promatranje izvan konvencionalne granice difrakcije.
Tradicionalna fluorescentna mikroskopija inducira fluorescenciju pomoću jedne vrste svjetla i dobiva slike isključivo na temelju te fluorescencije; stoga je bilo teško razlučiti strukture manje od 200 nm zbog difrakcijske granice. Nasuprot tome, STED se razlikuje kombiniranjem dva lasera vremenski i prostorno kako bi se potisnula okolna fluorescencija, čime se smanjuje efektivna veličina točke promatranja i zaobilazi difrakcijska granica.
Hellovi doprinosi i trenutni značaj STED-a
Dr. Stefan Hell prvi je teoretski predložio ovaj koncept 1994. godine, a 2000. godine uspješno je konstruirao STED mikroskop, proizvodeći slike sa znatno većom rezolucijom od konvencionalnih optičkih mikroskopa. Izvijestio je o rezultatima koji pokazuju približno tri puta poboljšanu rezoluciju slika E. coli i doprinio proširenju našeg razumijevanja sinaptičkih struktura promatranjem živih živčanih stanica.
Međutim, STED oprema je često teška za implementaciju i skupa, pa još nije široko prihvaćena u svim laboratorijima. Ipak, postizanje nanoskalne rezolucije pomoću optičkog mikroskopa označilo je značajnu prekretnicu u istraživanjima temeljne biologije i kemije.
