Dans cet article de blog, je présenterai un aperçu clair des principes et du contexte de la microscopie STED, ainsi que de ses applications biologiques et de son importance.

L'importance des microscopes et leurs limites actuelles

Le microscope est un outil essentiel en biologie. Son invention a permis la découverte des cellules et, depuis, la biologie a fait des progrès considérables. Cependant, les microscopes optiques traditionnels présentent des limitations physiques intrinsèques, rendant difficile l'observation des structures fines à l'intérieur des cellules ou des agencements à l'échelle nanométrique.
En particulier, les technologies optiques telles que la microscopie à fluorescence utilisent la lumière visible ; leur résolution est donc limitée par la longueur d’onde de cette lumière. Généralement, les structures plus petites que la moitié de la longueur d’onde (environ 200 nm) sont difficiles à distinguer. Malgré l’avantage de pouvoir observer des échantillons vivants, un problème se posait : la lumière provenant de deux points très proches interférait lors de son passage à travers l’objectif, les rendant indiscernables.

Concepts de base des états excités et de la fluorescence

Pour comprendre le principe de la STED, il faut d'abord comprendre les concepts de mécanique quantique d'« état fondamental » et d'« état excité ». Tant qu'une molécule ne reçoit pas d'énergie, elle demeure dans un état fondamental stable. Lorsqu'elle absorbe suffisamment d'énergie d'une source externe, son niveau d'énergie s'élève et elle entre dans un état excité.
Une molécule à l'état excité retourne à son état fondamental en un temps très court, émettant une lumière d'énergie égale à la différence entre l'état excité et l'état fondamental : c'est la fluorescence. La détection de ce signal de fluorescence pour obtenir une image de l'échantillon est le principe de base de la microscopie de fluorescence.

Comment fonctionne la microscopie STED ?

La microscopie STED (microscopie à déplétion par émission stimulée) est, comme son nom l'indique, une méthode qui réduit artificiellement la zone d'observation en diminuant la fluorescence grâce à l'émission stimulée. En bref, il s'agit d'une stratégie qui supprime la fluorescence environnante afin de confiner le signal de fluorescence observé à une zone très restreinte.
Le procédé se déroule comme suit : un premier faisceau laser est dirigé vers l’échantillon, excitant les molécules de la zone d’impact. Ces molécules sont alors prêtes à émettre une fluorescence. Immédiatement après, un second faisceau laser est superposé à la même zone ; ce second faisceau est réglé pour présenter une distribution d’intensité en forme d’anneau.
Lorsqu'un laser en forme d'anneau est superposé, une émission stimulée se produit dans la majeure partie de la région, à l'exception d'un point central très petit, forçant les molécules excitées à retourner à leur état fondamental. De ce fait, la fluorescence est observée uniquement dans cette région centrale extrêmement réduite (à l'échelle nanométrique), tandis que les zones environnantes perdent leur fluorescence. En déplaçant (balayant) le laser tout en réduisant progressivement la taille de cette région fluorescente centrale, il est possible d'obtenir une image haute résolution de l'échantillon entier.
En résumé, la zone d'observation peut être conceptualisée en trois régions spatiales : la zone entière excitée par le premier laser, la région environnante où la fluorescence est inhibée par le laser en forme d'anneau, et la très petite région centrale où la fluorescence est effectivement émise et observée. L'interaction de ces trois régions permet d'observer au-delà de la limite de diffraction conventionnelle.
La microscopie à fluorescence traditionnelle induit la fluorescence à l'aide d'un seul type de lumière et obtient des images basées uniquement sur cette fluorescence ; de ce fait, la résolution de structures inférieures à 200 nm était difficile en raison de la limite de diffraction. À l'inverse, la microscopie STED se distingue par la combinaison temporelle et spatiale de deux lasers afin de supprimer la fluorescence environnante, réduisant ainsi la taille effective du point d'observation et s'affranchissant de la limite de diffraction.

Les contributions de l'enfer et l'importance actuelle du STED

Le Dr Stefan Hell a proposé ce concept théoriquement pour la première fois en 1994, et en 2000, il a construit avec succès un microscope STED, produisant des images d'une résolution nettement supérieure à celle des microscopes optiques conventionnels. Il a publié des résultats montrant une résolution environ trois fois supérieure pour les images d'E. coli et a contribué à approfondir notre compréhension des structures synaptiques grâce à l'observation de cellules nerveuses vivantes.
Cependant, l'équipement STED est souvent difficile à mettre en œuvre et coûteux, ce qui explique son adoption encore limitée dans certains laboratoires. Néanmoins, l'obtention d'une résolution nanométrique grâce à un microscope optique a marqué un tournant décisif dans la recherche fondamentale en biologie et en chimie.