Tässä blogikirjoituksessa annan selkeän yleiskatsauksen STED-mikroskopian periaatteista ja taustasta sekä sen biologisista sovelluksista ja merkityksestä.
Mikroskooppien merkitys ja niiden nykyiset rajoitukset
Mikroskoopit ovat olleet ratkaisevan tärkeitä työkaluja biologiassa. Mikroskoopin keksiminen johti solujen löytämiseen, ja siitä lähtien biologia on kehittynyt valtavia harppauksia. Perinteisillä optisilla mikroskoopeilla on kuitenkin luonnostaan fysikaalisia rajoituksia, jotka vaikeuttavat solujen sisällä olevien hienojen rakenteiden tai nanomittakaavan järjestymien havaitsemista.
Erityisesti optiset tekniikat, kuten fluoresenssimikroskopia, käyttävät näkyvää valoa, joten niiden resoluutiota rajoittaa valon aallonpituus; yleensä alle puolet valon aallonpituudesta (noin 200 nm) olevia rakenteita on vaikea erottaa. Vaikka elävien näytteiden havaitseminen oli mahdollista, ongelmana oli, että kahdesta hyvin lähellä toisiaan olevasta pisteestä tuleva valo aiheutti interferenssiä kulkiessaan objektiivin läpi, mikä teki niistä erottamattomia.
Virittyneiden tilojen ja fluoresenssin peruskäsitteet
STED-periaatteen ymmärtämiseksi on ensin ymmärrettävä kvanttimekaaniset käsitteet "perustilasta" ja "viritystilasta". Ellei molekyyli saa energiaa, se pysyy vakaassa perustilassa. Kun se absorboi riittävästi energiaa ulkoisesta lähteestä, molekyylin energiataso nousee ja se siirtyy viritystilaan.
Virittyneessä tilassa oleva molekyyli palaa perustilaansa hyvin lyhyessä ajassa ja emittoi valoa, joka vastaa virittyneen ja perustilan välistä energiaeroa – eli fluoresenssia. Tämän fluoresenssisignaalin havaitseminen näytteen kuvan saamiseksi on fluoresenssimikroskopian perusperiaate.
Miten STED-mikroskopia toimii
STED-mikroskopia (Stimulated Emission Depletion Microscopy) on nimensä mukaisesti menetelmä, joka kaventaa keinotekoisesti havaintoaluetta vähentämällä fluoresenssia stimuloidun emission avulla. Lyhyesti sanottuna se on strategia, joka vaimentaa ympäröivää fluoresenssia rajoittaakseen todellisen havaitun fluoresenssisignaalin hyvin pienelle alueelle.
Tarkka prosessi on seuraava. Ensin näytteeseen kohdistetaan ensimmäinen lasersäde, joka virittää molekyylit osuma-alueella. Tässä vaiheessa alueen molekyylit ovat valmiita lähettämään fluoresenssia. Heti sen jälkeen samalle alueelle kohdistetaan toinen lasersäde; tätä toista sädettä säädetään siten, että sen intensiteettijakauma on donitsin muotoinen.
Kun donitsin muotoinen laser asetetaan päällekkäin, stimuloitua emissiota esiintyy suurimmassa osassa aluetta lukuun ottamatta hyvin pientä keskeistä pistettä, mikä pakottaa virittyneet molekyylit palaamaan perustilaansa. Tämän seurauksena fluoresenssia havaitaan vain erittäin pienellä keskeisellä alueella (nanoskaalassa), kun taas ympäröivät alueet menettävät fluoresenssinsa. Siirtämällä (skannaamalla) laseria samalla kun tätä keskeistä fluoresoivaa aluetta pienennetään asteittain, voidaan saada korkearesoluutioinen kuva koko näytteestä.
Yhteenvetona havaintoalue voidaan käsitteellistää kolmen alueellisen alueen avulla: koko ensimmäisen laserin virittämään alueeseen, ympäröivään alueeseen, jossa donitsinmuotoinen laser sammuttaa fluoresenssin, ja hyvin pieneen keskeiseen alueeseen, jossa fluoresenssi itse asiassa lähetetään ja havaitaan. Näiden kolmen alueen vuorovaikutuksen kautta havainnointi tavanomaisen diffraktiorajan ulkopuolella on mahdollista.
Perinteinen fluoresenssimikroskopia indusoi fluoresenssin käyttämällä yhtä valotyyppiä ja saa kuvia pelkästään tämän fluoresenssin perusteella; siksi alle 200 nm:n kokoisten rakenteiden erottaminen oli vaikeaa diffraktiorajan vuoksi. STED sitä vastoin erottuu yhdistämällä kaksi laseria ajallisesti ja spatiaalisesti ympäröivän fluoresenssin vaimentamiseksi, mikä pienentää havaintopisteen tehollista kokoa ja kiertää diffraktiorajan.
Helvetin panokset ja STEDin nykyinen merkitys
Tri Stefan Hell esitti tämän konseptin teoreettisesti ensimmäisen kerran vuonna 1994, ja vuonna 2000 hän onnistui rakentamaan STED-mikroskoopin, joka tuotti huomattavasti tarkempia kuvia kuin perinteiset optiset mikroskoopit. Hän raportoi tuloksista, jotka osoittivat noin kolminkertaisen resoluution parantuneen E. coli -kuvien resoluution ja laajensi ymmärrystämme synaptisista rakenteista havainnoimalla eläviä hermosoluja.
STED-laitteet ovat kuitenkin usein vaikeita ja kalliita, joten niitä ei ole vielä laajalti otettu käyttöön kaikissa laboratorioissa. Nanoskaalan resoluution saavuttaminen optisen mikroskoopin avulla merkitsi kuitenkin merkittävää käännekohtaa biologian ja kemian perustutkimuksessa.
