I dette blogindlæg vil jeg give et klart overblik over principperne og baggrunden for STED-mikroskopi, samt dens biologiske anvendelser og betydning.

Mikroskopers betydning og deres eksisterende begrænsninger

Mikroskoper har været et afgørende redskab inden for biologi. Opfindelsen af ​​mikroskopet førte til opdagelsen af ​​celler, og siden da har biologien gjort enorme fremskridt. Traditionelle optiske mikroskoper har dog iboende fysiske begrænsninger, hvilket gør det vanskeligt at observere de fine strukturer inde i celler eller arrangementer på nanoskala.
Især optiske teknologier som fluorescensmikroskopi bruger synligt lys, så deres opløsning er begrænset af lysets bølgelængde; generelt er strukturer mindre end halvdelen af ​​lysets bølgelængde (ca. 200 nm) vanskelige at skelne. Trods fordelen ved at kunne observere levende prøver, var der et problem, hvor lys fra to punkter meget tæt på hinanden forårsagede interferens, når det passerede gennem objektivlinsen, hvilket gjorde dem umulige at skelne.

Grundlæggende begreber om exciterede tilstande og fluorescens

For at forstå princippet bag STED, skal man først forstå de kvantemekaniske begreber "grundtilstand" og "eksciteret tilstand". Medmindre et molekyle modtager energi, forbliver det i en stabil grundtilstand. Når det absorberer tilstrækkelig energi fra en ekstern kilde, stiger molekylets energiniveau, og det går ind i en eksciteret tilstand.
Et molekyle i en exciteret tilstand vender tilbage til grundtilstanden inden for meget kort tid og udsender lys svarende til energiforskellen mellem den exciterede tilstand og grundtilstanden – det vil sige fluorescens. Det grundlæggende princip i fluorescensmikroskopi er at detektere dette fluorescenssignal for at opnå et billede af prøven.

Sådan fungerer STED-mikroskopi

STED-mikroskopi (Stimulated Emission Depletion Microscopy) er, som navnet antyder, en metode, der kunstigt indsnævrer observationsområdet ved at reducere fluorescens ved hjælp af stimuleret emission. Kort sagt er det en strategi, der undertrykker den omgivende fluorescens for at begrænse det faktisk observerede fluorescenssignal til et meget lille område.
Den specifikke proces er som følger. Først rettes en første laserstråle mod prøven, hvorved molekylerne i det område, den rammer, exciteres. På dette tidspunkt er molekylerne i det pågældende område klar til at udsende fluorescens. Umiddelbart derefter placeres en anden laser oven på det samme område; denne anden stråle justeres til at have en doughnutformet intensitetsfordeling.
Når den donutformede laser lægges oven på hinanden, forekommer stimuleret emission i det meste af området bortset fra en meget lille central plet, hvilket tvinger de exciterede molekyler til at vende tilbage til deres grundtilstand. Som et resultat observeres fluorescens kun i den ekstremt lille centrale region (på nanoskalaen), mens de omkringliggende områder mister deres fluorescens. Ved at bevæge (scanne) laseren, mens størrelsen af ​​denne centrale fluorescerende region gradvist reduceres, kan der opnås et billede med høj opløsning af hele prøven.
Kort sagt kan observationsområdet betegnes som tre rumlige områder: hele det område, der exciteres af den første laser, det omgivende område, hvor fluorescensen dæmpes af den donutformede laser, og det meget lille centrale område, hvor fluorescens faktisk udsendes og observeres. Gennem interaktionen mellem disse tre områder bliver observation ud over den konventionelle diffraktionsgrænse mulig.
Traditionel fluorescensmikroskopi inducerer fluorescens ved hjælp af en enkelt type lys og opnår billeder udelukkende baseret på denne fluorescens; derfor var det vanskeligt at opløse strukturer mindre end 200 nm på grund af diffraktionsgrænsen. I modsætning hertil adskiller STED sig ved at kombinere to lasere tidsmæssigt og rumligt for at undertrykke den omgivende fluorescens, hvorved observationspunktets effektive størrelse reduceres og diffraktionsgrænsen omgås.

Helvedes bidrag og den nuværende betydning af STED

Dr. Stefan Hell foreslog først dette koncept teoretisk i 1994, og i 2000 byggede han med succes et STED-mikroskop, der producerede billeder med betydeligt højere opløsning end konventionelle optiske mikroskoper. Han rapporterede resultater, der viste cirka tre gange forbedret opløsning i billeder af E. coli og bidrog til at udvide vores forståelse af synaptiske strukturer ved at observere levende nerveceller.
STED-udstyr er dog ofte vanskeligt at implementere og dyrt, så det er endnu ikke blevet bredt anvendt i alle laboratorier. Ikke desto mindre markerede opnåelsen af ​​nanoskalaopløsning ved hjælp af et optisk mikroskop et betydeligt vendepunkt inden for grundlæggende biologi- og kemiforskning.