В тази публикация в блога ще предоставя ясен преглед на принципите и предисторията на STED микроскопията, както и на нейните биологични приложения и значение.
Значението на микроскопите и техните съществуващи ограничения
Микроскопите са били ключов инструмент в биологията. Изобретението на микроскопа доведе до откриването на клетките и оттогава биологията е постигнала огромен напредък. Традиционните оптични микроскопи обаче имат присъщи физически ограничения, което затруднява наблюдението на фините структури вътре в клетките или на техните подредби в наномащаб.
По-специално, оптичните технологии като флуоресцентната микроскопия използват видима светлина, така че тяхната разделителна способност е ограничена от дължината на вълната на светлината; обикновено структури, по-малки от половината от дължината на вълната на светлината (приблизително 200 nm), са трудни за разграничаване. Въпреки предимството да се наблюдават живи проби, съществуваше проблем, при който светлината от две точки, много близки една до друга, причиняваше интерференция, докато преминаваше през обектива, правейки ги неразличими.
Основни понятия за възбудени състояния и флуоресценция
За да се разбере принципът на STED, първо трябва да се разберат квантово-механичните концепции за „основно състояние“ и „възбудено състояние“. Освен ако молекулата не получава енергия, тя остава в стабилно основно състояние. Когато абсорбира достатъчно енергия от външен източник, енергийното ниво на молекулата се повишава и тя навлиза във възбудено състояние.
Молекула във възбудено състояние се връща в основно състояние за много кратко време, излъчвайки светлина, равна на енергийната разлика между възбуденото и основното състояние – т.е. флуоресценция. Детекирането на този флуоресцентен сигнал за получаване на изображение на пробата е основният принцип на флуоресцентната микроскопия.
Как работи STED микроскопията
STED микроскопията (микроскопия със стимулирана емисия и изчерпване), както подсказва името, е метод, който изкуствено стеснява областта на наблюдение чрез намаляване на флуоресценцията с помощта на стимулирана емисия. Накратко, това е стратегия, която потиска околната флуоресценция, за да ограничи действително наблюдавания флуоресцентен сигнал до много малка област.
Специфичният процес е следният. Първо, първи лазерен лъч се насочва към пробата, възбуждайки молекулите в зоната, която поразява. В този момент молекулите в тази област са готови да излъчват флуоресценция. Веднага след това втори лазер се наслагва върху същата област; този втори лъч се настройва така, че да има разпределение на интензитета във формата на поничка.
Когато лазерът с форма на поничка се наслагва, стимулираната емисия се получава в по-голямата част от областта, с изключение на много малко централно петно, което принуждава възбудените молекули да се върнат в основното си състояние. В резултат на това флуоресценцията се наблюдава само в изключително малката централна област (в наномащаба), докато околните области губят своята флуоресценция. Чрез преместване (сканиране) на лазера, като същевременно се намалява постепенно размерът на тази централна флуоресцентна област, може да се получи изображение с висока резолюция на цялата проба.
В обобщение, зоната на наблюдение може да се концептуализира като три пространствени области: цялата област, възбудена от първия лазер, околната област, където флуоресценцията се гасва от лазера с форма на поничка, и много малката централна област, където флуоресценцията действително се излъчва и наблюдава. Чрез взаимодействието на тези три области става възможно наблюдение отвъд конвенционалната дифракционна граница.
Традиционната флуоресцентна микроскопия индуцира флуоресценция, използвайки един вид светлина, и получава изображения единствено въз основа на тази флуоресценция; следователно е трудно да се разделят структури с размер под 200 nm поради дифракционния лимит. За разлика от това, STED се отличава с комбинирането на два лазера във времето и пространството, за да потисне околната флуоресценция, като по този начин намалява ефективния размер на точката на наблюдение и заобикаля дифракционния лимит.
Приносите на Ада и текущото значение на STED
Д-р Стефан Хел за първи път предлага тази концепция теоретично през 1994 г., а през 2000 г. успешно конструира STED микроскоп, произвеждащ изображения със значително по-висока резолюция от конвенционалните оптични микроскопи. Той докладва резултати, показващи приблизително три пъти подобрена резолюция в изображенията на E. coli и допринася за разширяване на разбирането ни за синаптичните структури чрез наблюдение на живи нервни клетки.
Въпреки това, STED оборудването често е трудно за внедряване и скъпо, така че все още не е широко разпространено във всички лаборатории. Въпреки това, постигането на наномащабна резолюция с помощта на оптичен микроскоп бележи значителен поврат в изследванията по фундаментална биология и химия.
